变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素膜（孔径0.45um）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min——2h，凉干，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。

　　3．预杂交。湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸变性10min，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，用封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68℃水浴中保温3-12h，当预杂交液温度升至68℃时，在滤膜表面常会形成水气泡，轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。

　　4．杂交。　从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液，用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好足量的液体保持滤膜湿润（50ul/cm2）。溶液的组成是6×SSC，0.01mol/L　EDTA，变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口。杂交反应在68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般为4-20h。

　　5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中，室温下漂洗5min,再将滤膜移入2×SSC和0.1% SDS中，室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),然后将滤膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中，68℃轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。