引物二聚体(pcr引物二聚体特别亮)

基本原理

聚合酶链反应(PCR)是一种体外特异性核酸序列扩增技术。模拟DNA的自然复制过程由三个基本反应步骤组成:变性-复性-延伸。根据目标序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两条不同的寡核苷酸引物，分别与两条DNA链互补。将适量的寡核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合。DNA聚合酶和含有靶序列片段的模板DNA分子。经过高温变性(解链DNA双链)、低温复性(在模板上附着引物)和中温延伸(合成新的DNA片段)三个阶段的一个循环后，DNA的量可以增加一倍，30个循环后，DNA的量可以增加230倍。

典型的PCR反应系统和PCR的三个阶段

典型的PCR反应系统包括:

DNA模板

反应缓冲液

两个合成的DNA引物:dNTP和MgCl2(分别为上游引物和下游引物)

耐热Taq DNA聚合酶等

PCR的三个阶段如下:

模板DNA的变性:将模板DNA加热到94℃左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增形成的双链DNA解离下来，以便与引物结合，为下一步反应做准备；

模板DNA和引物的复性:当温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对；

引物的延伸:DNA模板-引物偶联物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种dNTP为反应原料，以靶DNA序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，合成一条与模板DNA链互补的新的半保守复制链。反复变性-复性-延伸可以获得更多的半保守复制链，这个新链可以成为下一个循环的模板。

实验用品

1.材料

枯草杆菌AS 1.398的基因组DNA溶液

2.试剂

2×Taq酶PCR反应混合物(含Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2和4 dNTP)；

上游引物，下游引物

石蜡油；

琼脂糖；

10×TBE电泳缓冲液:称取Tris108g、硼酸55g、Na2EDTA7.44g、双蒸水定容至1000mL

6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液；

EB溶液母液:将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；

DNA纯化试剂盒

DL2000TM DNA标记

3.工具

超级洁净工作台

加压釜

高速离心机

移液管

PCR放大器

卧式电泳槽

电泳仪电源

凝胶成像系统

电饭锅/电炉

实验步骤

引物设计

在NCBI上搜索了枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶(ALP)的基因序列。枯草海峡。168作为模板设计引物。根据表达质粒载体pET-28a-c (+)的DNA序列和图谱，用Primer Premier 5.0软件设计两对引物。BamH和Hind ⅲ的限制性位点分别设置在上游引物和下游引物上，这两个不同的限制性酶识别位点在引物中用下划线标出。引物序列如下:

上游引物:

5 '-cgggatccatgaaaaaaatgagttgt-3 '(BamHⅰ)

下游引物:

5 '-ccgaagcttttttttccagtttt-3 '(Hindⅲ)

基因增殖

提取的基因组DNA用作反应模板，使用合成的引物通过PCR扩增编码ALF的DNA序列。

加入上述试剂后，离心5 s混匀，加入20 μL石蜡油覆盖混合物，防止PCR时样品中的水分蒸发。

所有反应完成后，将PCR仪的温度设置为4℃。反应后，每个基因5μL经1%琼脂糖凝胶电泳检测，基因长度约为1400bp。添加样品DL2000TM DNA标记作为电泳标记。电泳后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照。

产品纯化

采用DNA纯化试剂盒进行纯化，具体步骤如下:

(1)PCR后，将反应液从PCR反应管移至干净的1.5mL Eppendorf离心管中，加入4倍体积的结合缓冲液混匀。将纯化柱放入收集管中，将混合物转移到柱中，并在室温下放置2分钟。

(2)以12000转/分钟的速度离心1分钟。

(3)从收集管中排出废液，将纯化柱放入同一收集管中，加入600 μ l洗涤液，以12000 r/min离心1 min。

(4)重复步骤(3)一次。

(5)排出收集管中的废液，将纯化柱放入同一收集管中，以12000转/分钟离心2分钟。

(6)将3S柱放入另一个1.5 mL离心管中，在纯化柱的膜中央加入30μ l Te，在37℃静置2 min。

(7)7)12000 r/min离心1 min，离心管内液体即为回收的DNA片段，可立即使用或-20℃保存备用。

需要注意的事项

1.1的灵敏度。PCR反应很高。为了防止污染，使用的0.2 mL Eppendorf管和吸头必须是新的、无污染、无酶的。实验操作应戴一次性手套，操作应尽可能在无菌操作台上进行。

⑷.使用工具酶和DNA样本的操作必须在冰浴条件下进行，使用后的剩菜应立即放回冰箱。

3.应设置包含除模板DNA外的所有其他成分的阴性对照。

4.引物的浓度一般为0.1 ~ 1.0μ mol/L，浓度过高会形成引物二聚体或增加非特异性产物。太低影响效率。

5.PCR产物应通过电泳进行鉴定，在纯化回收PCR产物前可获得分子大小相同的目的条带。

结果分析

对PCR产物的DNA凝胶电泳结果进行拍照和分析。