质粒构建(质粒构建及注意事项)

1.向量的构造

载体构建:载体构建是分子生物学研究中常用的方法之一。主要包括对现有载体多克隆位点(MCS)的改造和对现有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。为了将DNA分子运输到受体细胞，我们必须找到一种载体，它可以进入细胞，并在装载外源DNA片段后仍能复制。理想的载体是质粒。在基因工程中，经常使用人工构建的质粒作为载体。载体构建是含有外源DNA的质粒的构建。

特点:外源DNA片段插入质粒后，仍能自我复制。

2.多克隆位点

多克隆位点(MCS)指含有几个(最多20个)限制性位点的短DNA序列。又称多接头，是基因工程中常用的载体质粒的标准配置序列。MCS含有多个单一的限制性位点，这些位点是外源DNA的插入位点。每个限制性位点通常是唯一的，也就是说，它们在特定的载体质粒中只出现一次。不同酶的限制性位点可能重叠。单一切割位点是只有特定酶才能识别和切割的位点，多克隆位点通常是位于质粒上的序列，其包含许多切割位点，但这些切割位点中的每一个都被酶识别和切割。

3.质粒构建

(1)质粒构建的原理

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。其原理取决于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用。对目的基因和载体DNA进行适当的剪切和修饰后，在中连接在一起，然后导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的正确表达。

(2)质粒构建模式

质粒可以用各种方法构建。对于常规的T4连接酶，下面介绍用T4连接酶构建质粒的方法。T4连接酶可用于平端或粘端连接，但一般推荐使用粘端。

(3)质粒载体的制备

质粒可以通过一般推荐的单酶消化或双酶消化来制备。其实目的只有一个。尽量使载体的末端特定，防止自连。

4.当一般靶基因用于克隆表达时，限制性位点的选择应考虑:

(1)质粒上两个切割位点之间的距离不能小于过小(> 10bp)，否则会影响限制性内切酶对切割位点的识别，不利于空载体的双重切割。

(2)当一般的目的基因用于克隆表达时，限制性位点的选择应考虑到目的基因片段不含所选的限制性位点(否则，双酶切鉴定阳性重组体时，目的基因将被切断)。

(3)后续实验中使用的所有载体(真核、原核、酵母、昆虫)都尽可能含有所选的限制性位点。并确保载体上正确的插入方向(定向克隆)。(否则，当表达载体改变时，应重新设计引物以引入新的限制性位点)。

(4)尽可能选择比较常用的酶切位点(常见的酶切位点比较便宜)。

(5)两个酶切点之间至少有3个碱基。

(6)两种酶的切割点最好不是同一个尾酶(切割残基不应互补)，否则效果相当于单酶切割。

(7)最好使用效率高的酶。

(8)最好用两种酶配普通缓冲液。