质粒构建(学习质粒构建原理的五个步骤)

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于有限信息资源的作用，如核酸内切酶、DNA连接酶等修饰酶。对目的基因和载体DNA进行适当的切割和修饰后，连接在一起，然后导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的正确表达。

质粒可以用各种方法构建。对于常规的T4连接酶，下面介绍用T4连接酶构建质粒的方法。T4连接酶可用于平端或粘端连接，但一般推荐使用粘端。

1.质粒载体可以通过一般推荐的单酶消化或双酶消化来制备。其实目的只有一个。尽量使载体的末端特定，防止自连。

加水至50ul，在37C下孵育3~4小时，每隔一定时间摇动并离心，以防止液滴蒸发到试管盖上。酶切后，通过凝胶切割回收线性化的载体。

对于双消化1和2，在设置消化系统时要考虑NEBbuffer中的温度和活度，可以在NEB公司主页的双消化查找器中查询。

2.根据目的序列构建引物后，如果目的基因片段只有几十kb，可以选择退火使插入片段成为互补序列。

(1)引物设计法:以一个栗子为例。例如，如果选择的限制性内切酶是BGL III和HindIII，根据限制性位点的序列，粘性末端碱基序列被加到引物的两端。

引物的合成形式:5’-gatcnnnnnnnnnnnnnn-3’

3 '-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5 '

(2)按照以下touch dowN程序运行PCR仪95c和5min2C /s时为95–85C；0.1C /s时为85–25C；保持在4摄氏度.

3.线性化的质粒载体和退火产物通过T4 DNA酶连接。

T4 DNA酶连接通常选择16℃过夜。

注:连接可以通过选择公式计算，一般按照克隆载体与插入片段的最佳摩尔比为1:2，即最佳插入片段量为0.06 pmol。对应于这些摩尔数的DNA质量可以通过以下公式粗略计算:

克隆载体的最佳量= [0.02个克隆载体碱基对]ng (0.03 pmol)

插入片段的最佳量= [0.04个碱基对的插入片段]ng (0.06 pmol)

4.转换

将连接产物转化入受体细菌(通常为DH5a)，铺平板并培养过夜。注意质粒的抗性，选择相应的平板。

5.选择单克隆抗体并进行鉴定。

为了除去平板上的单克隆培养物，可以通过PCR或酶消化初步鉴定阳性克隆

对鉴定的阳性克隆进行测序。