细胞系构建(稳定细胞系构建)

构建稳定细胞植物的常用技术方法

1.通过构建稳定的基因表达细胞系

(基因过表达多克隆细胞系构建服务，基因过表达单克隆细胞系构建服务):

过表达细胞系构建服务包括目的基因过表达慢病毒载体的构建、病毒包装、细胞转染和筛选。客户只需提供目的基因的cDNA质粒和待构建的细胞系，我们将根据您的要求完成目的基因过表达细胞系的构建和检测，为您提供优质的基因过表达稳定细胞系。

2.RNA敲除稳定细胞系的筛选

(RNA干扰基因敲除细胞系多克隆构建服务，RNA干扰基因敲除细胞系单克隆构建服务):

我们的RNAi敲除细胞系是基于慢病毒表达系统。通常使用U6启动子驱动的pLVshRNA-puro载体或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体构建RNA干扰稳定细胞系，其服务包括干扰载体构建、靶标筛选、干扰效率验证和稳定细胞筛选克隆。

3.CRISPR敲除稳定细胞系的构建服务:

随着TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系统的出现，靶向基因敲除的难度大大降低。全新的技术将基因敲除从昂贵耗时的ZNF系统变成简单的研究工具。现在我们可以为Talen和Cas9/gRNA系统提供基因敲除服务。包括基因敲除靶设计、TALEN质粒组装、Cas9/gRNA质粒构建和基因敲除效率验证。

稳定细胞系的筛选方法

1.质粒转染后，通过单克隆方法筛选稳定的细胞系:

大多数细胞的转染效率较低。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达是可以接受的。但对于基因干扰实验，转染效率的要求远高于基因过表达，质粒转染达不到要求。

另外，质粒游离在细胞质中，降解快，长时间达不到检测项目；质粒转染整合的概率极低，稳定细胞系的构建费时费力，产量很低，往往需要选择单克隆系。

2.筛选病毒感染的稳定细胞系:

病毒感染法比质粒转染筛选单克隆法更方便高效，是目前稳定细胞系的主流筛选方法。慢病毒具有高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广、感染效率高、无需基因重排即可与细胞染色体整合等特点，是制备稳定细胞系的理想载体。

稳定细胞株通用服务流程

1.载体构建和病毒包装

一般来说，将人源化抗体基因转移到慢病毒载体中，然后检测质粒的表达，包装得到过量表达目的基因的慢病毒质粒。将慢病毒载体系统的包装成分与用于包装的载体成分一起转染到293细胞中。24至48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩并进行效价测试。

图1病毒包装和细胞感染

2.细胞转染

真核表达载体常用的抗性标记有嘌呤霉素、潮霉素和新霉素。首先确定嘌呤霉素/G418的筛选浓度和病毒转染浓度，然后将病毒悬液转染细胞24小时，用嘌呤霉素/G418筛选稳定的转化子，用ELISA和WB鉴定。

3.单克隆

利用分子ClonePix2系统，高通量自动筛选100-200个高水平分泌克隆，选出最佳的10个高产克隆进行下一步稳定性试验。

4.细胞系的稳定筛选

经过几代细胞系后，可能出现遗传不稳定性。筛选出10个最佳克隆，传代10次后，用qPCR和WB法检测细胞系的稳定性。最后，我们提供了序列和载体的报告，三个具有最佳表达的细胞系，表达分析，稳定性测试报告和详细的稳定细胞系构建报告。