lncRNA的引物设计(lncrna的常规分析)

摘要

非编码RNA (ncRNA)参与表观遗传调控，但对其知之甚少。在这里，我们以5个碱基对的分辨率描述了11个解剖位点中4个人类HOX基因座的转录景观特征，并鉴定了231个HOX ncRNAs，其将已知的转录区域扩展了30千个碱基。HOX ncRNAs沿着发育轴空表达，并且具有独特的序列基序。它的表达定义了一系列不同组蛋白甲基化和RNA聚合酶可及性的染色体区域。

研究成果

图1

图1:1:HOXA基因座的人类HOX转录组。

(a)位点特异性转录。左图:50，532个探针的杂交强度，这些探针拼接了11个样品中每个样品的人类HOXA基因座(用圆圈编号)。每个探针的强度显示为单个探针的强度除以阵列上所有301，027个探针的平均强度的log2的比值，每个探针的log2比值取100 bp窗口的平均值；红色条和绿色条分别表示高于或低于阵列平均值。编码HOX蛋白的基因的基因组位置显示为棕色方框。右图:关于发育轴的11个成纤维细胞样本的解剖学来源。

(b)通过瓦片阵列上的连续信号识别转录区域，然后与Refseq序列比较以确定基因[外显子(粉色)和内含子(蓝色)]和基因间转录区域(紫色)。每个预测的HOX外显子或内含子分别被命名为HOXn或int-HOXn。基因间转录区命名为ncHOXn，其中n是HOX旁系同源物，位于hox编码链NC RNA的3’端。

(c)所有四个HOX基因座的转录区域的总结，其定义了HOX基因、内含子和ncRNA转录区域的数量。

图2

图2:2:HOX ncRNA的位点特异性表达和一级序列基序。

(a)由HOX编码的转录物沿近端-远端轴差异表达。60个转录区(12个HOX基因和48个ncRNA)在远端成纤维细胞样品(脚、手指、包皮和前列腺)和所有其他细胞之间差异表达(P < 0.05，学生t检验)。高于或低于总中位数的每个转录区的表达水平用色标表示(线性标度为3至0.3倍，或log2标度为+1.6至-1.6倍)。转录本区域根据它们在染色体上的位置进行分类，样品通过这60个转录本的表达相似性进行分级聚类。蓝色方框和黄色方框分别表示HOX的侧枝同源基因与飞胸(UBX)或触角腹(Antp)的进化起源。

(b)由HOX编码的转录物沿着前部和后部解剖区域差异表达。总共92个转录物(6个HOX基因，86个ncRNA)在原代前或原代后成纤维细胞培养物中(脐上或脐下)差异表达(P < 0.05，学生t检验)。每个ncRNA的表达如(a)所示。

(c)基于其表达模式，序列基序在HOX ncRNA中富集(p < 10-9)。ncRNAs的一级序列中富集的序列基序的语码图超过了未翻译的HOX序列，或者ncRNAs的远端、近端或后面的表达模式。在前部解剖部位表达的ncRNA的一级序列基序没有预期的多。

图3

图3:在原代肺(上)或足(下)成纤维细胞(Fb)的HOXA位点的~100 kb转录活性中，占据HOXA位点的Suz12、H3K27me3、pol II与染色质修饰和转录可及性完全相反。对于码片数据，码片/输入的log2比率绘制在Y轴上。对于RNA数据，杂交强度以线性比例显示。虚线突出了染色质修饰和基因间转录之间相反构型的边界。

图4

图4:在4:HOXC位点的反义基因之间的ncRNA HOTAIR的长度。

(a)hot air在两个染色质域边界的基因组位置。芯片和RNA在拼接阵列上的表达如图3所示。

(b)链特异性RT-PCR显示HOTAIR在HOXC基因的相对链中的独特表达(底部)。针对HOTAIR的顶端端(引物F1-F3)或底端链(引物R1)，设计了用于逆转录(P-RT)和PCR(P-PCR)的引物。

(c)肺和包皮成纤维细胞RNA中的热空气体的Northern印迹分析。

(d)通过含有HOTAIR寡核苷酸库(组1-3)和全长反义HOTAIR或miRNA let7a的探针检测大片段和小片段的小RNA。

(e)通过qrtpcr检测HOTAIR在人成纤维细胞后部和远端的表达。每个成纤维细胞样本的来源由解剖卡通上的样本号表示。" A "来自头皮。X轴上显示了相对于头皮(最前面)的每个位置的热空气的相对丰度。

(f)在10.5天的全胚胎(上图)和后肢和尾部(左下图和右下图)中用HOTAIR sense(下链)或antest(上链)探针进行全胚胎原位杂交。突出显示HOTAIR后肢(箭头)和尾巴(箭头)的表情。

图5

图H3K27的三甲基化和Suz12在5:HOXD位点的占据需要HOTAIR。

(A)与针对GFP的对照siRNA相比，H3K27me3芯片-芯片信号的变化A) HOXD基因座是由HOTAIR的耗尽引起的。HOXD基因的位置用棕色方框表示。

(b)靶向GFP或HOTAIR的siRNA处理后，H3K27me3和HOXD位点选择性启动子的Suz12的芯片。下图:芯片检测定量(平均标准误差)。

结论

我们在HOXC基因座发现了一个2.2千碱基的ncRNA，称为HOTAIR，它通过HOXD基因座的40千碱基抑制转录。hot和多梳抑制复合物2 (PRC2)之间的相互作用对于PRC2的占据和组蛋白H3赖氨酸-27在HOXD位点的三甲基化是必需的。因此，ncRNA的转录可能在一定距离内定义了基因沉默的染色体区域；结果这些对发育和疾病状态的基因调控具有广泛的意义。

DOI:10.1016/j.cell.2007.05.022

参考

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