多肽的固相合成(多肽的固相合成技术)

1.聚合物载体固相合成肽需要固相载体和连接分子来连接固相和反应物。载体和连接分子的正确选择决定了固相合成法的成功。固相合成肽中使用的载体多为聚苯乙烯和二乙烯基苯等聚合物的衍生物和苯乙烯共聚物，如氯树脂、Pam树脂、Wang树脂和氨基树脂。载体树脂的溶胀状态对缩合反应的相关因素有明显的影响，如缩合试剂和羧基成分的自由扩散以及肽链之间的聚集。为了使载体具有良好的溶胀性能，并具有足够容纳不断增长的长肽链的大网络空，便于反应物进入载体，一般采用交联度为1% ~ 2%的聚苯乙烯珠状树脂或微孔树脂。

2.连接分子固相合成肽使用了连接不同连接分子的聚合物，它们是含有氯甲基、巯基甲基、酰氯、对苯甲酰基、芳基磺酰氯、烯丙醇、琥珀酰、邻硝基苯甲醇和二苯基氯硅烷等的双功能化合物。一个理想的接头分子在整个合成过程中必须非常稳定，并且在合成后可以被定量切割，而不会破坏合成的目标分子。合适的连接分子的选择也应该基于与树脂连接的肽的C-末端的结构类型，并且相应的衍生物如羧酸、酰胺或氨基醇可以在切割后产生。

固相合成肽的检测

即使是高效的偶联技术，酰化反应也不能保证100%。此外，当遇到空间位阻或双层序列时，偶联反应的效率将大大降低。聚合物载体上总是存在缺失或截短的多肽链，它们也在解离过程中进入产物，给分离带来很大困难。因此，固相合成肽时，各氨基酸的缩合率应达到99.9%，尤其是肽较长时，否则产物会非常不纯。因此，监控响应每个步骤的进度尤为重要。(杭州特产肽生物拥有20多年的固相合成经验，能够满足大部分客户的需求)

1定性显色反应茚三酮显色法(Kaiser法)是利用茚三酮显色反应快速测定树脂上的氨基，从而判断酰化反应是否完成。茚三酮法检测聚苯乙烯树脂中氨基的灵敏度可达5 mol/g，以此灵敏度可检测缩合反应是否在99%以上。当检测到茚三酮时，由于不同的末端氨基酸残基和序列，颜色强度不同。天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)会产生淡蓝色或浅棕色。显色剂2，4，62三硝基苯磺酸与树脂上的氨基反应呈橙红色，灵敏度为5摩尔/克树脂。

凯泽试剂包括:

茚三酮的6%乙醇溶液

乙醇中80%的苯酚

c、2%吡啶溶液2%0.001MKCN

制备的吡啶需要用茚三酮处理，然后在使用前重新蒸熟。检测过程中，取少量树脂，加入2-3滴A、B、C，100℃加热1-2分钟。如果溶液为蓝色，或者树脂为蓝色或红棕色，则表示有游离氨基，否则连接完成。还有其他检测游离氨基的方法:三硝基苯磺酸法、苦味酸法、溴芬法等。

2定量游离氨基检测水杨醛法用于测定肽接枝后树脂上残留氨基的量和脱保护基后总氨基的量，可定量检测缩合反应和脱保护基反应是否完全。如果不完整，可以及时反复处理。用2%水杨醛+6%吡啶乙醇溶液与树脂上的氨基反应(60℃，30 ~ 35分钟)。清洗后，用5%苄胺乙醇溶液(60℃，30分钟)代替水杨醛。用苄胺乙醇溶液稀释后，读取315nm的光吸收值，计算氨基的数量(= 4.36±11)该方法对NH2含量高于0.15mol/mg树脂的样品的相对偏差在5%以内。

3部分保护中间肽的HPLC检测在多肽合成过程中，取少量肽树脂(3 ~ 10 mg)进行裂解，用乙醚沉淀，溶于适当溶剂中直接进行HPLC分析。在切割过程中，肽的氮末端保护基团根据需要被保留或去除。当合成的肽为短极性肽时，可以保留保护基，否则在HPLC中保留时间太短，不利于分析。这种方法虽然麻烦，但耗时短，精度高。

反应溶剂

二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是肽固相合成中常用的溶剂，尤其是DMF因其对反应物和产物的高溶解度而被广泛应用于各种反应体系中。DMF虽然溶解度较好，但沸点较高，需要减压蒸出。此外，副产物N-酰基脲在高介电常数的溶剂(二甲基甲酰胺、氰酰胺、二甲基亚砜、H2O等)中容易生成。)，但在低介电常数溶剂(CH2Cl2、CCl4、C6H6等)中不易生成。).在非极性溶剂中，N-保护的氨基酸能迅速与DCC反应生成对称酸酐。因此，只要反应物能够溶解，应尽可能使用低介电常数的溶剂。在固相合成中，DCM多用作溶剂，它具有两个优点:外消旋速率比DMF小，N-酰基脲形成较慢。当羧基成分难以溶解时，加入几滴重蒸馏的DMF，帮助溶解。

缩合试剂主要有碳二亚胺型和鎓盐型(Uronium)。

碳二亚胺型

主要包括DCC、DIC、EDC。氯化氢等。DCC用于反应。由于反应中产生的DCU在DMF中溶解度小，产生白色沉淀，一般不用于固相合成。然而，由于其价格低廉，在液相合成中可以通过过滤去除，其应用仍然相当广泛。因为它的水溶性，EDC。盐酸被广泛应用于多肽和蛋白质的连接，并且相当成功。然而，这种类型的缩合试剂最大的缺点之一是，如果单独使用，会有更多的副反应。然而，研究表明，如果在活化过程中加入HOBt、HOAt等试剂，副反应可以控制在很低的范围内。

盐类型

盐缩合试剂反应活性高、速度快，目前应用广泛，主要包括HBTU、TBTU、HATU、PyBOP等。在试剂的使用过程中需要加入有机碱，如二异丙基乙胺(DIEA)和N-甲基吗啉(NMM)，只有加入试剂后，氨基酸才能被激活。

固相合成工艺

1.以羟基树脂为载体的合成方法(以王树脂为例:图1)

王树脂、聚丙烯酰胺树脂、树脂和沙斯林树脂在接头结构中都含有苯甲醇基团。在大多数情况下，预先形成的N-保护氨基酸的对称酸酐和催化剂DMAP(对二甲氨基吡啶)与羟基树脂反应。在这个结合反应中。DMAP是必要的，但它也带来一些麻烦。例如，当一些空间位阻大、反应活性低的Fmoc-氨基酸需要较长的反应时间时，DMAP纯度不理想。一些Fmoc基团将被去除，一些二肽将被生成。更常见的危险是，当作为C端第一个氨基酸的Cys和His与羟基树脂反应时，DMAP经常使这两个氨基酸外消旋。所以解决办法是用Cl-Trt树脂与这两个氨基酸键合，也可以生成酯Linker。另一种解决方案是使用试剂[Fra I388，Ren 1998]，可以有效避免Cys和His与各种羟基树脂键合时的外消旋危险。

图1固相多肽合成

2.以三苯甲基树脂为载体的合成方法(图2)

三苯甲基(trt)树脂具有三苯甲基结构，因此具有极高的反应活性。通常，将等摩尔量的受保护氨基酸和4倍的DIEA树脂和Trt树脂混合在二氯甲烷中，反应在室温下30-12分钟完成。对于未反应的位点，可以用甲醇封闭这些位点。基于Trt Linker温和结合、温和裂解的特性，在这种树脂上浓缩皮肤碎片，制备完全保护的皮肤碎片是一种理想的方式。

图2固相多肽合成

FMOC固相合成谷氨酸-色氨酸

3.一种以氨基树脂为载体的合成方法

MBHA树脂、PAL树脂、克诺尔树脂、林克-NH2树脂等。它们都含有氨基，可以在接头中与羧酸反应。C端第一个氨基酸与其结合的反应条件与肽接枝循环中的条件完全相同。如果使用DCC作为缩合剂，N-保护氨基酸、DCC和HOBT通常混合在溶剂(DMF、THF、DCM等)中。)生成氨基酸的HOBT活性酯，静置3-5小时。活化反应几乎完成后，过滤出副产物DCU沉淀，将羧基活化组分溶液与氨基树脂混合进行键合反应。这一步有两点值得注意:①大多数氨基树脂的氨基不是以游离状态出售的。一些氨基以盐酸盐的形式存在，而另一些则有临时保护基团(如Fmoc、Boc等)。)，因此在与C端的第一个氨基酸结合之前，有必要中和或去除临时保护基团。②氨基酸活化组分的用量应远高于氨基树脂组分，一般摩尔比为(2-5): 1，才能使键合反应接近100%，因为氨基酰化树脂不能从产品中去除。过量组分的使用是所有固相有机合成的共性。

除了DCC，其他常见的冷凝剂还有DIC、EDC、EDEQ、HBTU等。