细胞检测(中国七大干细胞库)

细胞增殖作为活细胞的重要生理功能之一，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖的研究方法有很多。那么，今天跟大家分享的检测方法有哪些呢？不多说，往下看~

MTT法

MTT是一种黄色化合物，一种接受氢离子的染料。它可以作用于活细胞线粒体中的呼吸链。在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，形成四唑环裂纹和蓝色甲状晶体。甲状晶体的数量只与活细胞的数量成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能减少MTT)。

实验方法:

接种XXX细胞:用含10%胎牛血清的培养基制备单细胞悬液，将每孔1000-10000个细胞接种到96孔板中，每孔体积为200 L。培养细胞在相同的一般培养条件下培养3-5天(培养时间可根据试验目的和要求确定)。在颜色培养3-5天后，向每个孔中加入20升MTT溶液(5毫克/毫升，含PBS)。继续孵育4小时，停止培养，小心吸取并丢弃孔中的培养上清液，然后在悬浮细胞离心后吸取并丢弃孔中的培养上清液。向每个孔中加入150升二甲基亚砜，振荡10分钟，使晶体完全溶解。选择490nm的比色波长，在酶联免疫传感器上测量每个孔的光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

甲基四氮盐

XTT是一种类似于MTT的四唑鎓衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原为水溶性棕色甲襞产物。当XTT与电子偶联剂一起使用时，甲襞的产生量与细胞增殖程度呈正相关。

实验方法:

首先制备6.6毫摩尔/升XTT溶液和220毫摩尔/升吩嗪硫酸二甲酯(PMS)溶液。XTT和PMS以1: 1的比例混合，形成XTT/PMS。XXX细胞:用含10%胎牛血清的培养基制备单细胞悬液，接种于96孔板，每孔1000-10000个细胞，每孔体积200 L。细胞培养:与一般培养条件相同，培养3-5天(培养时间可根据试验目的和要求确定)。培养终止前2小时，向每个孔中加入XTT/PMS 20L，混合后培养2小时。在微孔板读数器上以655纳米的参考波长在450纳米测量光的吸收率。

WST-1

该方法是一种灵敏度高、稳定性好、无放射性的比色检测方法，用于细胞增殖或毒性试验中活细胞数量的测定。与其他四唑盐如MTT、XTT和MTS相比，本实验的灵敏度更高，线性范围更宽。

实验方法:

将100 L/孔(约1104个)的XXX细胞加入96孔板，在5% CO2细胞培养箱中于37℃培养24小时。加入适当浓度的测试化合物。在含有5% CO2空气体和100%湿度的细胞培养箱中于37℃培养96孔板适当时间。使用WST-1细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒，向每个孔中加入10 L四唑盐工作溶液。37℃孵育1 ~ 4小时。微孔板读数器检测每个孔在450纳米波长下的光密度。

CCK-8(WST-8)

CCK-8是近年来发展起来的一种新型水溶性四唑盐检测方法。其原理类似于WST-1:在电子载体1-甲氧基-5-甲基苯酚嗪硫酸甲酯(1-甲氧基PMS)的作用下，被细胞线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的甲状体，具有很高的水溶性。甲的量与活细胞数成正比，酶联免疫法测得的光吸收值可以间接反映活细胞数的，在一定的细胞数范围内甲的量与细胞数成正比。

实验方法:

将细胞悬浮液(100升/孔)接种在96孔板中。培养板在培养箱(37℃，5% CO2)中预培养。细胞被处理后。每孔加入10 L CCK溶液(注意不要在孔内产生气泡，会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱中培养1-4小时。用酶标仪测量450纳米处的吸光度。如暂不测量OD值，可向每孔加入10L 0.1m HCl溶液或1%w/v SDS溶液，培养板可在室温下避光保存。吸光度在24小时内不会改变。

平板克隆形成

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁细胞。合适的基材是玻璃、塑料瓶皿。实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞必须分散良好，不能有细胞团，接种密度不能太高。

实验方法:

取对数生长期单层培养的XXX细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹成单细胞，然后悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中备用。以梯度倍数稀释细胞悬液，接种于细胞密度适宜的培养皿中(根据增殖能力)。一般将每皿50、100、200个细胞的梯度密度接种到含10ml 37℃预温培养液的培养皿中，轻轻旋转使细胞均匀分散。将其置于37℃ 5%CO2和饱和湿度的环境中，静置2 ~ 3周。当培养皿中出现可见克隆时，培养终止。弃去上清液，小心蘸取并用PBS洗涤两次。加入5mL纯甲醇或1:3醋酸/甲醇，固定15分钟。然后去除固定液，加入适量姬姆萨用染料溶液染色10 ~ 30 min，然后用流动水慢慢冲洗染料溶液，用空气体干燥。倒置平板，覆盖一层有网格的透明膜，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜下(低倍率)计数50个以上细胞的克隆数。最后，计算克隆形成率。克隆率=克隆数/接种细胞数100%。

软琼脂克隆形成

软琼脂培养通常用于检测肿瘤细胞和转化细胞系。当试验琼脂与细胞混合时，琼脂温度不应超过40℃。接种细胞的密度不超过每平方厘米35个，一般在6厘米的平板上接种1000个细胞。正常细胞在悬液中不能增殖，不适合软琼脂克隆形成试验。

实验方法:

取对数生长期的XXX细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹成单细胞，计数活细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养基调节细胞密度至1106细胞/L。然后根据实验要求进行梯度倍数稀释。分别用蒸馏水配制1.2%和0.7%浓度的低熔点琼脂糖溶液。高压灭菌后，保持在40℃不凝固。将1.2%琼脂糖与2DMEM培养基(含2种抗生素和20%小牛血清)按1:1的比例混合后，取3mL混合液注入直径6cm的平板(10cm平板加7 ~ 10 ml)中，冷却固化后作为底层琼脂，放入CO2培养箱中备用。将0.7%琼脂糖和2DMEM培养基在无菌试管中按1:1的比例混合后，向试管中加入0.2mL细胞悬液，充分混合均匀，倒入装有1.2%琼脂糖的底板中，形成一层一层的双层琼脂。上层琼脂凝固后，置于37℃的5% CO2培养箱中培养10 ~ 14天。将平板置于倒置显微镜下，观察细胞克隆的数量。计算形成率。

溴脱氧尿苷

BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，在复制细胞中可以选择性地整合到新合成的DNA中，而不是胸腺嘧啶(细胞周期S期)。这种能够稳定存在，并以DNA复制的方式进入子细胞。BrdU特异性抗体可用于检测BrdU的掺入情况，从而判断细胞增殖能力。

实验方法:

将细胞密度为1.5105/mL的XXX细胞接种于直径35 mm的培养皿(内有盖玻片)中，培养1天，与0.4%FBS培养基同步培养3天，使大部分细胞处于G0期。加入BrdU(储备溶液:1.0毫克/毫升，最终浓度:0.03克/毫升)，并在37℃孵育40分钟。丢弃培养液，用PBS清洗载玻片3次。甲醇/乙酸固定10分钟。用固定载玻片空气体干燥后，0.3%H2O2-甲醇灭活内源性氧化酶30分钟。5%正常兔血清阻断。甲酰胺在100℃变性5分钟。冰浴冷却后，用PBS洗涤，加入抗小鼠BrdU单克隆抗体1个抗体(工作浓度1: 50)，阴性对照加入PBS或血清。免疫组化常用的ABC法进行检测，苏木精或伊红染色，显微镜下随机计数10个高倍视野的细胞总数和BrdU阳性细胞，计算标记指数LI。

今天在这里分享关于细胞增殖的研究方法，记得转发收藏，下次再和大家分享细胞转移~

如果你需要相关实验，点击下面了解更多。

了解更多信息