高效液相色谱分析(高效液相色谱基本原理)原创丁当学术2020-01-19 20:37:34

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高效液相色谱是色谱的一个重要分支，具有广泛的应用和对样品的广泛适用性。它不受分析对象的挥发性和热稳定性的限制。几乎所有的化合物，包括高沸点化合物、极性化合物、离子化合物和大分子物质，都可以用高效液相色谱法进行分析测定，从而弥补了气相色谱法的不足。在已知的有机化合物中，大约20%可以通过气相色谱进行分析，而80%需要通过高效液相色谱进行分析。高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度好的特点，能够分析和分离沸点高、不能气化的热不稳定生理活性物质。它已成为分离分析技术在化学、医学、工业、农业、商品检验和法律检验等领域的重要应用。

一

基本原理

色谱的分离原理是:当溶解在流动相中的各组分通过固定相时，由于与固定相相互作用(吸附、分布、排斥和亲和)的大小和强度不同，以及在固定相中的保留时间不同，各组分相继从固定相中流出。也称为色谱法和色谱法。

高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上，以液体为流动相，采用高压输液系统。将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂和缓冲液等流动相泵入具有极细颗粒的高效固定相的色谱柱中。柱内成分分离后，进入检测器进行检测，从而实现样品的分析。

图1。高效液相色谱分析流程

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系统组成

高效液相色谱系统一般由输液泵、注射器、色谱柱、检测器、数据记录和处理装置等组成。输液泵、色谱柱和检测器是关键部件。此外，梯度洗脱装置、在线脱气器、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。也可以根据需要进行配置。现代高效液相色谱仪还具有微机控制系统，用于仪器自动控制和数据处理。制备型高效液相色谱仪还配有自动馏分收集装置。

图2。高效液相色谱仪的系统组成

1.输液系统

输液泵是高效液相色谱系统中最重要的部件之一。输液泵根据输出液体恒定的因素分为恒压泵和恒流泵。泵的性能直接影响整个系统的质量和分析结果的可靠性。

输液泵根据工作方式可分为气动泵和机械泵。机械上有螺杆驱动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复隔膜泵。

表1。几种高压性能泵的性能比较

高效液相色谱使用的输液泵应满足以下条件:

①流速稳定，其RSD应小于0.5%，这对定性定量分析的准确性非常重要；

②流量范围宽，分析型应在0.1 ~ 10毫升/分钟范围内连续可调，配制型应达到100毫升/分钟；；③输出压力高，一般应达到150 ~ 300kg/cm2；

④液压缸体积小的；

⑤密封性能好，耐腐蚀。

(1)往复柱塞泵

当活塞向外运动时，泵头出口止回阀关闭，流动相入口止回阀打开，溶液(流动相)被泵入活塞缸。当柱塞被推入气缸时，入口止回阀关闭，出口止回阀打开，流动相被压出活塞气缸，流向色谱柱。双活塞往复泵的输液流量远小于单活塞泵。其优点是不需要使用阻尼器来消除脉冲，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节比单活塞泵复杂。往复柱塞泵的特点是连续供给恒定体积的流动相，不受整个色谱系统其他部分阻力微小变化的影响。

图3。单活塞往复柱塞泵的结构(a)和双活塞往复柱塞泵的结构(a)和排液特性(b)

(2)隔膜往复泵

隔膜往复泵也是一种恒流量泵。当活塞与油接触时，隔膜受到油压的作用，吸引或推动流动相部分，使流动相部分的单向阀吸入或排出液体，从而获得稳定的液体流量。隔膜泵的活塞不与流体直接接触，因此不存在活塞垫片磨损对流动相的污染。隔膜泵死体积小(约0.1mL)，因此更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。然而，隔膜泵结构复杂且昂贵。

4.隔膜往复泵结构示意图

(3)气动增压泵

气动增压泵是一种恒压泵。泵头通常由两部分组成——止回阀和密封圈——柱塞杆。通常，单向阀由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成。在压力的作用下，红宝石球离开阀座，流动相流经单向阀。相反，在反作用力的作用下，宝石球回到阀座，流动相不再流过止回阀。

2.脱气装置

由于溶解氧或与空气体混合，流动相溶液经常形成气泡。当气泡进入检测器时，色谱图上会出现尖锐的噪声峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，进入流路或色谱柱的大气泡会使流动相流速变慢或使流速不稳定，导致基线波动。气泡一旦进入色谱柱，需要很长时间才能排出。在荧光检测中，溶解氧也可以淬灭荧光。溶解的气体也可能导致一些样品氧化或改变溶液的酸碱度。

目前液相色谱流动相脱气广泛采用离线超声振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。

超声波脱气:将准备好的移动连接容器放入超声波水槽中脱气10- 20min。这种方法比较简单，基本能满足日常分析和操作的要求，所以目前仍被广泛使用。

惰性气体鼓泡吹扫脱气:将气源(钢瓶)中的气体(氦气)缓慢均匀地引入储液罐中的流动相中，其他气体分子被氦气分子替代，但其在溶剂中的溶解度很小，微量氦气形成的小气泡对检测没有影响。

真空空脱气器:流动相通过一段多孔合成树脂膜制成的输液管，输液管外有一个真空空容器。当真空空泵工作时，膜外减压，小分子量的氧气、氮气和二氧化碳会由内向外进入膜内被去除。

图5。真空在线除气器示意图

3.梯度洗脱装置

HPLC有等度洗脱和梯度洗脱两种方式。等容洗脱是指流动相组成在同一分析周期内保持不变，适用于组分少、性质差异小的样品。梯度洗脱是在一个分析循环中控制流动相组成的过程，如溶剂极性、离子强度和pH值等。用于分析成分多、性质差异大的复杂样品。梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分辨率，改善峰形，提高检测灵敏度，但往往会造成基线漂移，降低重现性。由两种溶剂组成的梯度洗脱可以任意程度的混合，即有很多洗脱曲线:线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。最常用的是线性梯度，特别适合在反相柱上进行梯度洗脱。

梯度:在一定时间内连续均匀地增加流动相的强度。

步骤:直接从一个低强度流动相换到另一个高强度流动相。

梯度洗脱可以通过两种方式实现:低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。

高压梯度一般只用于二元梯度，即使用两台高压泵按设定的比例将A、B流动相输送至混合器。它具有精度高、易于实现自动控制的优点。

图6。高压梯度装置结构示意图

低压梯度只需要一个高压泵。与等度洗脱输液系统相比，在泵前安装一个比例阀，在比例阀内完成混合。常压下混合容易形成气泡，因此低压梯度通常配备在线脱气器。

图7。四级低压系统结构示意图

4.采样系统

使用安装在色谱柱入口处的早期隔膜和断流取样器。目前多采用六通取样阀或自动取样器。采样装置要求:密封性好，死体积小，重复性好，保证集中采样，采样时对色谱系统的压力和流量影响小。

通常，六通取样阀常用于高效液相色谱分析。六通阀有两种取样方法:部分填充法和完全填充法。

①进样的部分充液法:进样量应不超过定量环体积的50%(最大为75%)，进样量应准确，每次相同。该方法的准确性和重复性取决于注射器采样的熟练程度，且容易因采样而产生峰展宽。

②完全充液法采样:采样量应不少于定量环体积的5~10倍(至少3倍)，以完全替代定量环中的流动相，消除壁效应，保证采样的准确性和重复性。

图8。六通取样阀结构原理示意图

5.分离系统

分离系统包括色谱柱、保护柱和柱烘箱。

色谱柱:色谱是分离分析的手段，分离是核心，所以负责分离的色谱柱是色谱系统的心脏。色谱柱由柱管、压帽、套圈(密封圈)、筛板(过滤器)、连接器、螺钉等组成。色谱填料是制备后用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是粒径为5-10 μm的球形颗粒。色谱柱根据用途可分为分析型和制备型，具有不同的尺寸和规格:

①常规分析柱(恒柱)，内径2 ~ 5毫米(常用4.6毫米，国内4毫米、5毫米)，柱长10 ~ 30厘米；

②窄孔(又称小直径柱和半微柱)，内径1~2mm，柱长10 ~ 20cm；

③内径为0.2 ~ 0.5 mm的毛细管柱(也称微柱)；

④内径> 5 mm的半制备柱；

⑤实验室配制的柱，内径20 ~ 40毫米，柱长10 ~ 30厘米；

⑥生产制备柱:内径可达数十厘米。

图9。色谱柱结构示意图

保护柱:保护柱的主要作用是防止吸附性强的杂质污染柱，从而延长柱的寿命。对于不同类型的色谱柱，应选择带有相应填料的保护柱。需要注意的是，柱芯使用寿命长，应定期更换。

柱烘箱:保持色谱柱温度恒定，避免保留时间变化，保证分离效果稳定。

6.探测器

检测器是连续监测色谱柱分离出的流出液成分和含量变化的装置，是高效液相色谱仪的三大关键部件之一。高效液相色谱检测器要求灵敏度高、噪声低(即对温度、流速等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好、适用范围广。

。2 .基本特征。高效液相色谱常用检测器

7.数据处理系统

该系统可以对测试数据进行采集、存储、显示、打印和处理，从而可以正确进行样品的分离、制备或鉴定。