实时定量PCR分析的部分实施需要进行优化，确保所有反应参数设置准确，从而获得准确的结果。荧光定量PCR常见的难点包括引物、探针、反应抑制和软件分析。今天，小姐姐分享她在引物和探针方面的经验。

实时定量PCR几乎是现代分子生物学中最重要、应用最广泛的核酸定量检测技术。成功的定量PCR实验离不开准确的实验设计和操作流程。

引物二聚体

引物二聚体的形成是最常见的问题之一。当引物对之间的一些序列具有同源性时，可以形成引物二聚体。如果引物在聚合酶链反应过程中退火形成二聚体，Taq DNA聚合酶可以延伸二聚体形成比原始引物更长的产物，这可能导致循环过程中更容易出现退火错误。

问:引物二聚会引起哪些问题？

引物二聚体对反应的影响很大程度上取决于反应中使用的化学物质。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大，这是因为探针退火和断裂的现象很少发生在引物二聚体区域。此时，引物的竞争是需要考虑的主要问题。基于双链DNA结合染料的反应受引物二聚体的影响很大。因为染料的结合模式是非特异性的，所以在反应过程中监测的荧光信号可以被增强。这可以相应地改变Ct值，使结果偏离。

问:如何确定是否存在引物二聚体？

凝胶电泳是显示引物二聚体的一种很好的方法。引物二聚体在凝胶底部形成扩散带，通常低于100 bp。单纯凝胶电泳的缺点是灵敏度最低只有纳克级，所以可能得不到结果。

熔解曲线也是显示引物二聚体的一种方法。如果扩增具有优异的特异性，实时荧光定量PCR平板上每个反应孔的解离曲线将具有狭窄的单峰。引物二聚体的荧光强度低，显示出宽的“波形”，表明它在约70℃熔化(见图1)。

问:如何设计和优化实验以避免引物二聚体？

最好在引物设计阶段采取简单的预防措施，避免从一开始就形成二聚体。如果出现引物二聚体，有很多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。

1.第一步是优化热循环条件，主要是提高退火温度。大多数情况下，两步循环(从95°C变性步骤直接到60°C退火和延伸步骤)有利于强扩增，因此引物设计中成功设定的退火温度为60°C。

2.它可以降低引物浓度，甚至有助于使用不同比例的正向引物和反向引物。大多数情况下，每个引物的理想最终浓度为200~600 nM，但必要时可降至60 nM。

3.镁的最佳浓度一般在3 mM左右，超过这个浓度，引物二聚体容易形成。

4.如果尚未评估引物形成二聚体的趋势，则应进行补充和重新设计(如有必要)。通常情况下，在环境下，最好使用热启动DNA聚合酶并在冰上反应。

5.理论上，对于同一目标，应该同时检测多个引物组。事实上，这可以节省很多时间，因为如果这些引物中的一个可以立即工作，则可以减少优化过程中花费的时间。

引物和探针的储存

引物和探针储存不当会导致降解和特异性丧失，进而影响反应效率。影响引物和探针稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否长时间暴露、储存引物和探针的浓度以及储存液的成分。

问:如何长期保持引物和探针的稳定性？

保持引物和探针的稳定性有四个关键点。低压冻干引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。一旦引物重新溶解，应在-20℃下储存，如果储存超过一年，应监测其功能是否下降。对于标记的引物和探针，应采取措施避免标记物暴露(例如，使用不透明的试管并将其置于黑暗中)，以延长其使用寿命。

引物浓度也会影响其稳定性。建议引物贮存浓度不低于10m；；事实上，在大多数情况下，100 M引物浓度更容易操作。引物和探针也应分开储存，以减少冷冻和解冻时间，特别是标记的引物和探针。最后，TE缓冲液可以形成比水更稳定的环境。此外，含有0.1 mM EDTA(标准TE中1 mM EDTA)的TE缓冲液是理想的溶液，因为某些PCR反应可能对EDTA有一定的残留敏感性。

NTC放大

当引物二聚体形成时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可以观察到荧光信号。在另一种情况下，在存在污染物的情况下，无论是基于探针或双链DNA结合染料的反应，在NTC孔中也将观察到引物二聚体的扩增。这可能是一个随机事件，并不是所有的NTC都会被放大，这通常是由不寻常的采样错误引起的。如果在每个NTC反应中发生扩增，很可能有一种或两种试剂被污染。

问:如何防止或消除污染？

1.使用干净的工作台，用含有核酸降解试剂的溶液擦拭工作台。

2.使用含有dUTP和UDG的反应预混物降解预聚合酶链反应的产物，防止预聚合酶链反应的污染。

3.尝试用新的反应管更换不同来源的试剂，找出有问题的试剂。

4.如果条件允许，在不同的实验位点建立反应，特别是当质粒用作对照时(质粒容易扩散，难以去除)。

实时定量聚合酶链反应分析确实需要时间来优化过程，但花费的时间是值得的。该分析结果不仅灵敏度最高、动态范围最大，而且准确度高、效率高、重复性好，为实验提供了可靠的数据。