蛋白质检测方法(三种常用的测定蛋白质浓度的方法)测定蛋白质浓度的方法有很多。科研人员广泛使用的方法，如紫外吸收法、缩二脲法、BCA法、劳里法、考马斯亮蓝法、凯氏定氮法等。现已小批量使用紫外法、BCA法和考马斯亮蓝法，详细介绍了这三种方法测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作和注意事项。

蛋白质检测方法(三种常用的蛋白质浓度测定方法)。

紫外线法

这种方法是在280纳米波长下直接测试蛋白质。选择Warburg公式，光度计可以直接显示样品的浓度，或者选择相应的换算方法将吸光度值换算成样品的浓度。蛋白质的测定过程很简单，先测试空白酒，然后直接测试蛋白质。所以结果很不稳定。蛋白质直接定量法适用于成分相对单一的纯蛋白质的检测。与比色法相比，紫外直接定量法快速、易操作。但易受百特网对平行物质的干扰，如DNA干扰。此外，灵敏度低，蛋白质浓度高。

(1)简单经验公式:蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45 * od 280-0.74 * od 260]*稀释系数。

(2)精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到修正系数f，再通过以下公式计算出最终结果:

蛋白质浓度(毫克/毫升)= f *(1/天)* od280 *天。

其中d为测量OD值的比色杯厚度。

d是溶液的稀释倍数。

BCA方法

原理BCA(bichinchoninic acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂混合成苹果绿，即BCA工作试剂。碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，工作试剂由苹果绿变为紫色络合物。在562 nm处，光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

BCA蛋白质浓度测定试剂盒和Abbkine的蛋白质定量试剂盒(BCA方法)提供了一种简单、快速和洗涤剂兼容的方法来准确定量总蛋白质。

成分A100毫升试剂B2毫升标准蛋白1毫升2.1毫克/毫升。

储运温度:室温(标准蛋白在4 ~ 8℃运输)。

储存温度:室温(标准蛋白质储存在-20℃)。

生效日期:12个月。

施用方式

方法1: 96孔板1。BCA工作液的配制:根据标准品和样品的数量，按照试剂a 50倍体积，试剂B 1倍体积，配制适量的BCA工作液..混合均匀。

2.在96孔板的蛋白质标准孔中加入0升、1升、2升、4升、6升、8升和10升蛋白质标准。加入灭菌的双蒸馏水补足至10 L。取10 L待测样品，加入96孔板的样品孔中。每次测定应进行2 ~ 3次平行。

3.将200 L BCA工作液(即样品与工作液的体积比为1:20)加入待测样品池和蛋白标准池中，混匀。

4.37℃水浴30分钟。冷却至室温。

5.在562 nm处用微孔板读数器测量吸光度。

6.制作标准曲线。根据标准曲线计算样品浓度。

蛋白质浓度测定的三种常用方法(详解)
方法二:试管法。

1.工作液的配制:根据标准品和样品的数量，按50倍体积的试剂a和1倍体积的试剂b配制适量的BCA工作液，充分混合均匀。工作溶液的量应与用于测定的比色杯相对应。每次测定应进行2 ~ 3次平行。这里列出的比色系统使用0.5毫升比色杯。如果比色皿的规格不同，则需要将系统扩大到准确读取实验中使用的比色皿所需的体积。

2.牛血清白蛋白标准品和样品的制备:样品用水或其他不干扰显色反应的缓冲液制备，使待测浓度位于标准曲线的线性部分。为每个反应准备了三个平行的分析。标准曲线通常有5~6个点。根据估计的样品浓度确定每个点的具体浓度。牛血清白蛋白可以用水或与样品一致的溶液稀释。如果待测样品浓度约为200克/毫升，可按下表所示顺序加入牛血清白蛋白标准品、样品和BCA工作液。

3.取适量标准蛋白，按蛋白液与工作液的比例=1:20混合均匀。37℃温水浴30分钟。冷却至室温。

4.测量样品和标准品在562 nm处的吸光度。

蛋白质浓度测定的三种常用方法(详解)
考马斯亮蓝法。

实验考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是一种基于蛋白质-染料结合原理的快速、灵敏的微量蛋白质浓度定量测定方法。这种蛋白质方法比其他方法具有突出的优势，因此得到了广泛的应用。目前，该方法是最灵敏的蛋白质测定方法之一。

考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料最大吸收峰(lmax)的位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色由棕黑色变为蓝色。通过测量595 nm处光吸收的增加，可以知道与其结合的蛋白质的量。发现染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸(尤其是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合。

突出最佳点(1)灵敏度高，估计比Lowry法高4倍左右，其最低蛋白检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后颜色变化较大，蛋白质-染料复合物的消光系数较高，所以光吸收值随蛋白质浓度的变化远大于Lowry法。

(2)测定快速简单，只需一种试剂。完成一个样品的测定只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程可以在2分钟左右完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，5分钟至20分钟之间颜色稳定性最好。所以完全没有必要像Lowry方法那样花时间，严格控制时间。

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(3)干扰物质少。例如K+、Na+、Mg2+、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等。干扰洛瑞法的不干扰本测定方法。

缺点(1)由于各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝染色法用于测定不同蛋白质时偏差较大，在制作标准曲线时通常采用g-球蛋白作为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰本方法的测定。主要干扰物质有洗涤剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

试剂和设备1。里根考马斯亮蓝试剂:

将100毫克考马斯亮蓝g-250溶解在50毫升95%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，并用蒸馏水稀释至1000毫升。

2.待测标准和蛋白质溶液(1)标准蛋白质溶液。

结晶牛血清白蛋白，预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，根据其纯度，用0.15 mol/L NaCl配制1 mg/mL蛋白质溶液。

(2)待测蛋白质溶液。血清，使用前用0.15摩尔/升氯化钠稀释200倍。

3.设备试管1.515厘米(6个)，试管架和移液管0.5毫升(2个)；1毫升(2)；5毫升(1)；恒温水浴；分光光度计。

行动1。制作标准曲线，取7个试管，按照下表并行操作。

摇匀，1 h内用0号管作为空白色对照，595 nm进行比色。

绘制标准曲线:以A595 nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度的测定方法同上，取适当的未知样品体积，使其测量值在标准曲线的直线范围内。根据测得的A595 nm值，在标准曲线上找到相当于标准蛋白的量，计算未知样品的蛋白浓度(mg/mL)。

注(1)加入试剂后，在5-20分钟内测量光吸收，因为在此期间颜色最稳定。

(2)测定过程中，小部分蛋白-染料复合物会吸附在比色杯壁上。测定后，可用乙醇洗涤蓝色比色杯。

(3)使用考马斯亮蓝法分析蛋白质时，需要掌握分光光度计的正确使用方法。重复测量吸光度时，比色杯必须清洗干净。制作蛋白质标准曲线时，最好从低浓度到高浓度测量蛋白质标准，以防出错。